雑誌名：Bioscience of Microbiota, Food and Health
ジャンル：原著論文（査読あり）
掲載年：2018年
原題：Stimulation of murine cell-mediated immunity by dietary administration of a cell preparation of Enterococcus faecalis strain KH-2 and its possible activity against tumour development in mice.
研究機関： 株式会社栄養・病理学研究所（筆頭著者・塚原，第二著者・中村），有限会社バイオ研，NPO法人日本サプリメント臨床研究会，株式会社ブロマ研究所
弊社職員の役割：研究統括，研究企画，飼育観察，剖検，ナチュラルキラー活性及び細胞障害活性測定（フローサイトメトリー），RNA抽出，脾臓細胞中のNK活性関連因子mRNA発現解析（real-time PCR），脾臓細胞中の活性型T細胞割合測定（フローサイトメトリー），結果考察，論文執筆

内容解説：組織中のmRNA発現解析は，被験物質給与後の生体応答を確認する意味でも重要です。例えば，今回例示いたしました論文でも，Enterococcus faecalis KH2株の経口給与によって脾細胞中のナチュラルキラー (NK) 活性を検討するために関連遺伝子（パーフォリン1, グランザイムA，グランザイムBなど）のmRNA発現を解析しております。今回の論文では，このNK活性化をメカニズムとして，がん細胞増殖抑制を説明しております。
以下に弊社で採用しております方法を記載いたします。

①採材時に動物組織をRNA-laterに浸漬し，解析時まで-80℃で凍結保存する。
②解凍後，滅菌PBSで組織を洗浄する。
③組織を15 mg精密に秤量し，ジルコニアボール入りねじ口チューブへいれる。
④QuickGene RNA tissue kit (クラボウ) 及びQuickGene 810 systemを用い，RNAを抽出する。方法はキット添付の取扱説明書に準拠する。
⑤RNA抽出液から市販逆転写酵素を用いて逆転写を行う。方法は取扱説明書を参照する（弊社ではタカラバイオ製のPrimeScriptもしくはTOYOBO製のReverTra Aceを用いております）。
⑥Roche社HPにあるUniversal ProbeLibrary Assay Design Centerから，目的とする遺伝子のTaqMan Probe及びプライマー配列を決定する。
⑦Rotor-Gene Q (キアゲン)を用いてリアルタイムPCRを行う。
⑧対象とするmRNAのCt値をハウスキーピング遺伝子のmRNA発現で補正し，ΔΔCt値として結果を表す。
　以上のように弊社では，Roche社製のUniversal ProbeLibraryを採用することで，比較的安価にTaqManリアルタイムPCRが実施できるようにしております。機能性食品の生体応答を評価する場合，重要なツールとなってきます。