雑誌名：Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition
ジャンル：原著論文
掲載年：2022年
原題：Fermented rice bran supplementation ameliorates obesity via gut microbiota and metabolism modification in female mice
研究機関： 鈴鹿医療科学大学，福井大学，株式会社マックスプロバイオ，株式会社栄養・病理学研究所（第三著者・川瀬，第四著者・塚原）
弊社職員の役割：菌叢網羅解析，総菌数測定，有機酸濃度測定，メタボロミクス（GC-MS），胆汁酸成分解析

【検体の前処理】
① 標準物質としてCholic acid（CA），α-muricholic acid（αMCA），β-muricholic acid（βMCA），Chenodeoxycholic acid（CDCA），Deoxycholic acid（DCA），Hyodeoxycholic acid（HDCA），Ursodeoxycholic acid（UDCA），Lithochollic acid（LCA），Taurocholic acid（TCA），Tauro-α-muricholic acid（TαMCA），Taurochenodeoxycholic acid（TCDCA），Taurodeoxycholic acid（TDCA），Taurohyodeoxycholic acid（THDCA），Taurolithocholic acid（TLCA），Glycocholic acid（GCA），Glycochenodeoxycholic acid（GCDCA），Glycodeoxycholic acid（GDCA），Glycohyodeoxycholic acid（GHDCA），Glycoursodeoxycholic acid（GUDCA）及びGlycolithocholic acid（GLCA）を用い，各物質の濃度が5 mmol/Lとなるように超純水で濃度調整します。
② 内部標準物質として，2,3-Nordeoxycholic acid（NDCA）を用い，濃度が5 mmol/Lとなるようにメタノールで濃度を調整します。
③ 胆汁酸分析用試料に内部標準物質15 µL，エタノール1.0 mLを加え，2,500 rpmで10分間ボルテックス後，30 min，60 ℃の条件でインキュベートします。その後さらに，100 ℃の熱湯で3 min加熱します。室温で放冷しボルテックス後，5,000 rpm ×10 min，4 ℃の条件で遠心分離し，上清を新しい回収用チューブに移します。残渣にエタノール1.0 mLを加えボルテックス後，10,000 rpm ×1 min，4 ℃の条件で遠心分離し，上清を先述の回収用チューブに移します。この操作をもう一度繰り返し，回収用チューブをエバポレーターにかけて減圧乾固させます。完全に乾燥したことを確認し，メタノール500 µLを加え，ボルテックスを行います。予めコンディショニングしておいたWaters製のOASIS HLB固相抽出カートリッジに10 mM酢酸アンモニウム水溶液を1 mL加え，ただちにサンプル100 µLをロードし十分にピペッティングを行います。液が全て落下したことを確認し，洗浄用に10 mM酢酸アンモニウム水溶液を1 mLを加え，30 min～1h静置します。液が全て落下したことを確認した後，カートリッジの下に新しい回収用チューブをセットし，メタノール1 mLを加えて胆汁酸を分析用バイアルに移します。

【UPLC-MS/MSを用いた定量】
① 分析には弊社所有のUPLC-MS/MS (ACQUITY UPLC；Waters)を用いて行っております。装着するカラムはAcquity BEH C18 1.7 μm×100×2.1 mm (Waters)です。分析条件は以下となります。A液：20 %アセトニトリル（10 mM酢酸アンモニウム添加）。B液：80 %アセトニトリル（10 mM酢酸アンモニウム添加）。流速は0.4 mL/minとし，グラジエント条件は0-5 min (A液95 %)，5-15 min (A液95-85 %)，15-20 min (A液85-75 %) ，20-22 min (A液75-25 %)，22-26 min (A液25 %)です。インジェクション量は5 μL，カラム温度は40℃，サンプル温度は4℃です。
② 質量分析計での検出：弊社所有のACQUITY TQD MS system (Waters)を用いて行っております。条件は以下となります。イオン化はESI negative，キャピラリー電圧は3.0 kV，脱溶媒ガスは800 L/hr，脱溶媒温度は400 ℃，イオン源ヒーターは150 ℃，コーンガス流量は50 L/hrです。MRM条件など詳細は下記論文をご参照下さい。

以上となっております。これらの分析法については，以下のリンクに示す論文に記載されておりますので，併せてご確認いただければ幸いです。